解码复杂样品 | 非液体基质生物分析的最佳实践与建议-鼎泰药研

解码复杂样品 | 非液体基质生物分析的最佳实践与建议

2025-05-09

非液体基质样品（NLMs）、生物分析、“Fit-For-Purpose (FFP)”验证、替代基质

全文共：3833 字 30 图

预计阅读时长：20 分钟

随着核酸药物、细胞与基因治疗等创新治疗产品的研发，非液体基质样品（Non-Liquid Matrices Samples,NLMs）的分析数据对于理解药物吸收、分布、靶标结合及调控机制至关重要，同时也可以为药效和安全性评估提供更立体的数据支撑。但是，目前行业内没有统一的标准化流程和明确的指南指导 NLMs 的采集、处理、保存和分析，致使该类样品分析结果的可比性和可靠性受到较大限制。因此，如何实现 NLMs 的合理采集、高效处理及科学分析，已经成为生物分析领域亟待解决的核心问题。鼎泰集团生物分析团队结合 AAPS 专家工作组最新发表的白皮书“Best Practices and Recommendations for Non‑Liquid Matrices Bioanalysis”及内部 NLMs 分析项目为你梳理生物样品收集、处理及分析的最佳实践，以飨同道，共享参考！

★ 文章导览 ★

01	NLMs 介绍及科学分析的挑战
02	NLMs 获取注意事项 2.1 NLMs 采集和运输 2.2 NLMs 预处理 2.3 NLMs 储存和稳定性
03	NLMs 分析结果标准化
04	NLMs 分析最佳实践与建议 4.1 NLMs 生物分析方法开发和验证 4.2 PK 与生物标志物的 NLMs 生物分析 4.3 NLMs 生物分析的替代基质
05	案例分享 5.1 文献中 NLMs 项目案例 5.2 鼎泰 NLMs 项目案例
06	结语

NLMs 介绍及科学分析的挑战

非液体基质样品（Non-Liquid Matrices Samples, NLMs）是指除传统液体生物样品（如血清、血浆）外的多种生物样品，包括组织（如肝脏、肿瘤）、粪便、细胞、皮肤、毛发、骨骼等，常见的 NLMs 如图1。

图1. 非液体基质类型示例（NLMs）

与液体基质生物样品相比，NLMs 具有高度异质性、采集及处理步骤复杂性、储存和稳定性挑战大等常见特点（见表1），因此也为下游的生物分析带来巨大的挑战（见图2）^[1]。

表1. 液体基质与 NLMs 的异同

图2. NLMs 的主要分析难点

NLMs 获取注意事项

由于 NLMs 的质量会极大的影响生物分析结果的可靠性，因此需要生物分析科学家参与到试验设计、样品采集、运输、处理和保存等全部流程，确保获得的样品能够满足分析的需要。

图3. NLMs 的采集和分析的关键步骤

NLMs 采集和运输

NLMs 的采集和运输需要严格标准化操作，其主要目的是避免交叉污染、样品降解、减少个体间差异并保证组织间均一性等，从而确保生物样品完整性，为后续分析提供高质量样品。

图4. NLMs 采集和运输流程

NLMs 预处理

NLMs 预处理是通过系统性操作将复杂基质转化为可分析状态的关键步骤，通常包括匀浆、裂解和目标分析物提取等步骤。根据分析物性质、组织类型、分析方法的检测平台等因素选择不同的处理方法。近期 GCC 新发表建议统计了来自全球 20 多家 CRO 公司对组织样品预处理的方法选择：机械破碎占比50%，超声处理占比5%，酶/化学消化法占比 0%，组合方法 45%^[2]。

另外，推荐 NLMs 采集后妥善保存，转移至生物分析实验室进行统一、标准的预处理。

表2. NLMs 大分子、小分子预处理流程^[2][3]

NLMs 储存和稳定性

NLMs 的储存方法对分析物的稳定性至关重要，不当的储存方法可能导致分析物降解或结构发生变化。组织样品建议采用快速冷冻或匀浆后低温保存的方法。对于细胞样品，需要根据分析物的性质选择适宜的储存条件（见表3）。

表3.组织、匀浆、细胞和细胞裂解物的储存和稳定性^[1]

NLMs 分析结果标准化

在 NLMs 的分析中，由于生物样品的异质性和复杂性，其分析结果的标准化是确保数据可比性和科学可靠性的关键。与常规的液体基质样品分析不同（如血清、血浆结果通常以基质中单位体积的分析物质量 ng/mL 或摩尔浓度 μM 报告）， NLMs 分析结果需要根据样品特性和分析目标进行标准化。NLMs 分析结果标准化的详细策略及建议见下表4。

表4. NLMs 分析结果的标准化

NLMs 分析最佳实践与建议

NLMs 生物分析方法开发和验证

NLMs 生物分析方法开发和验证的合规性和科学性是药物研究流程中连接非临床与临床研究的关键纽带，直接影响研发效率以及产品的安全性和有效性评估。ICH M10 指南建议：“在注册申请研究资料中，对于涉及的主要基质应进行完整的方法验证，并应对其他检测基质进行部分验证”^[11]。针对 NLMs 的特殊性，方法开发及验证需要基于具体的应用场景进行科学设计：对于关键研究中的主要基质需要完整的验证；而对于辅助或探索性研究中的基质，可以采取更灵活的部分验证即基于研究目的（Fit‑for‑purpose，FFP）的验证。针对色谱法、配体结合分析（LBA）和实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）中 NLMs 开发和验证所需参数及其接受标准的建议见下表5.

表5. NLMs 分析方法的开发及验证内容

PK 与生物标志物的 NLMs 生物分析

PK 分析主要针对外源性的药物及其代谢物（如小分子化学药、生物药）；生物标志物分析通常检测内源性分子（如蛋白、核酸、代谢物），需要区分基线水平与给予药物后的变化。NLMs 的生物分析在常规药物的 PK 分析与生物标志物分析中具有不同的考虑因素，其基质选择的建议见表6。

表6. PK 与生物标志物生物分析的 NLM 选择

近期 GCC 针对组织中生物标志物分析进行了深入讨论，并给出了最新的行业建议（见表7）。

表7. 组织中生物标志物分析^[2]

NLMs 生物分析的替代基质

在 NLMs 生物分析时，若遇到目标空白基质不可获得、数量有限或珍稀，或者生物样品中的空白基质含有干扰分析物的内源性物质等情形，则可能需要使用替代基质。为了确保替代基质可以应用于生物样品分析，以下介绍了替代基质的选择策略及组织样品替代基质的生物分析建议：

1) 生物标志物分析中替代基质的选择策略

替代基质是一种用于制备标准曲线样品和质量控制样品的模拟基质，其特征是不含目标分析物，同时尽可能模拟真实生物样品基质的理化性质和干扰因素 ^[12]。理想的替代基质应该具备适用性、可获得性、经济性和稳定性。大分子、小分子生物分析方法替代基质的选择策略见下表8。

表8. 大分子、小分子生物分析方法替代基质的选择策略

图5. LBA 方法选择有效替代基质的方法^[12]

图6. LC-MS 选择有效替代基质的流程图^[12]

2) 组织中替代基质的生物分析

在组织样品分析领域，替代基质方法的出现带来了新的机遇。即使在缺乏真实空白基质的情况下，该方法依然能够实现对组织中分析物的定量。然而，为了确保替代基质方法的可靠性和准确性，在将其应用于实际的组织样品分析之前，先对替代基质的有效性以及整个分析方法的性能进行全面且严谨的评估^[13]。以下是评估替代基质有效性的方法：

◆ 比较标准曲线斜率

通过在替代基质和真实组织匀浆液中制备标准曲线，并比较两种基质的标准曲线斜率来判断替代基质是否合适。

◆ 评估质控（QC）样品的准确性

通过在替代基质中制备标准曲线，检测替代基质和真实基质匀浆液中制备的 QC 样品。

◆ 比较分析物回收率

检测分析物在替代基质和真实组织匀浆液中的回收率是否相似（或与基质无关）。

◆ 评估基质效应

检测替代基质和真实组织的基质效应是否相似。

替代基质中的方法性能评估是确保其可靠性的关键步骤，“Fit-for-purpose”同样适用于组织中替代基质的性能评估，根据数据的预期用途来确定评估的内容。以下是在方法开发阶段应测试的关键参数：

图 7. 替代基质方法开发关键参数

案例分享

文献中 NLMs 项目案例

本案例为了比较玻璃体内注射 ADVM-022 和阿柏西普后眼组织中阿柏西普的浓度水平，定量分析了眼组织（视网膜、脉络膜）中的阿柏西普^[14]

表9. 检测眼组织中阿柏西普的方法

图8. 眼组织中阿柏西普浓度-时间曲线图^[14]

本案例开发了一种基于 4%BSA 的 PBS 缓冲液作为替代基质的 LC-MS/MS 方法，用于同时定量分析眼组织（玻璃体、视网膜-脉络膜）中 sGC 及其靶点生物标志物 cGMP^[15]

表10. 替代基质检测眼组织中 sGC 和 cGMP 方法

图 9. 眼组织中 sGC 及 cGMP 浓度-时间曲线图^[15]

本案例为了比较 C57BL/6 小鼠和食蟹猴中 AAV 转导效率的潜在差异，静脉注射混合 AAV 后定量分析 C57BL/6 小鼠和食蟹猴的不同组织中载体 RNA^[16]

表11. 检测不同组织中载体 RNA 的方法

图 10. C57BL/6 小鼠和食蟹猴中不同组织载体 RNA 含量图^[16]

鼎泰 NLMs 项目案例

鼎泰集团依托丰富的项目经验和先进的技术平台，在 NLMs 生物分析领域积累了多项成功案例，涵盖核酸药物、疫苗及基因治疗药物等前沿领域。我们凭借专业团队和先进设备，熟练掌握了 NLMs 的采集、预处理及生物分析的方法开发，并建立了 NLMs 空白基质资源库，为后续研发和分析工作提供了坚实基础。

表12. 鼎泰项目案例分享

图11. 新西兰兔给药后组织药物浓度-时间曲线图

图12. 食蟹猴给药后组织 DNA 含量-时间柱形图

结语

NLMs 的生物分析将会随着新型治疗产品的发展成为生物分析领域的重要分支，在药物开发进程中将会发挥举足轻重的作用。然而，由于该领域复杂性较高，且目前尚缺乏明确且统一的指导规范，使得 NLMs 的生物分析面临着诸多挑战。但值得期待的是，随着越来越多相关经验和数据的积累，NLMs 的生物分析将不断得到优化和完善。未来有望建立起更加成熟、系统的标准化流程和指南，为药物开发提供更加精准、可靠的数据支持，助力新型治疗产品的研发与推广。

截至目前，鼎泰集团已累计完成 100 多个 NLMs 分析方法开发、验证及样品分析工作，支持 50 多种新型治疗产品（CGT、特殊递送系统/给药方式等）的非临床及临床试验的开展，积累了丰富的实践经验（如施能康 siRNA 药物 SNK-2726、因诺惟康 AAV 眼科基因治疗药物 IVB103、中因科技 AAV 治疗药物 ZVS203e 等）。未来，我们将持续关注行业动态、不断突破技术瓶颈和提升服务质量，同时也期待与行业同仁深入探讨和交流，共同推动新型治疗产品生物分析技术的进步和提升。

供稿：生物分析中心Ⅰ部

参考资料：

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